Картирование и определение первичной структуры генома человека. Картирование генома человека Картирование семинара в режиме реального времени – Лэндмарк форум
Независимо от того, наследуется ли болезнь по одному из менделирующих типов или просто чаще встречается у родственников больных, генетический вклад в болезнь состоит из генотипических различий среди членов семьи или вызывающих болезнь, или изменяющих в ту или другую сторону восприимчивость к болезни.
Геномика , завершив исследование последовательности ДНК человека в ходе реализации проекта « », обеспечила генетиков полным списком всех генов человека, знаниями об их положении и структуре и каталогом нескольких миллионов вариантов последовательностей ДНК, обнаруженных в разных популяциях. Некоторые из этих вариантов весьма частые, другие редкие, остальные различаются по частоте в разных этнических группах.
Некоторые варианты имеют явные функциональные последствия , другие - несомненно, нейтральны. Для большинства значение для человеческого здоровья неизвестно.
Мы также очертили роль отбора и дрейфа генов , влияющих на частоту различных аллелей в популяции. В статьях на нашем сайте МедУнивер мы обсудим, как процесс мейоза, действуя во времени и в пространстве, определяет связь между генами и полиморфными локусами с их окружением.
Сначала мы представим, какую информацию о «генетическом пейзаже » генома человека дали исследования наследования генетических вариантов, а затем опишем два фундаментальных метода идентификации генов болезни. Первый метод, анализ сцепления, основан на обследовании семей.
Анализ сцепления имеет явные преимущества перед семейными родословными для определения наследования болезни в нескольких поколениях, позволяя обнаружить последовательную постоянную передачу конкретного региона генома всякий раз, когда болезнь передается в семье. Второй метод, анализ ассоциаций, основан на обследовании популяций. Анализ ассоциаций прямо не зависит от родословных, но исследует повышение или снижение частоты конкретного аллеля ил» набора аллелей в выборке больных, взятой из популяции, по сравнению с контрольной группой здоровых людей.
Анализ ассоциаций имеет преимущество перед анализом всей популяции для поиска аллелей, более или менее часто обнаруживаемых у больных по сравнению со здоровой контрольной группой.
Исследования сцепления и ассоциации для идентификации генов болезней оказало огромное влияние на понимание патогенеза и патофизиологии многих болезней. Эти знания также позволили предложить новые методы профилактики, лечения и контроля.
Как картирование генов помогает медицинской генетике?
Картирование генов болезней имеет непосредственное клиническое применение, обеспечивая информацию о позиции гена, используемую для разработки методов косвенного анализа сцепления в пренатальной и пресимптоматической диагностике и выявлении носительства.
Картирование генов болезни критически важно для начального поиска гена болезни. Картирование фокусирует внимание на ограниченном регионе генома для выполнения систематизации всех имеющихся в нем генов, так что мы можем найти мутации или варианты, которые содействуют болезни (позиционное клонирование).
Позиционное клонирование гена болезни обеспечивает возможность охарактеризовать заболевание по степени локусной гетерогенности, спектру аллельной гетерогенности, частоте различных патогенных или предрасполагающих к болезни вариантов в различных популяциях, пенетрантности и ожидаемой частоте мутаций, доле общего генетического вклада в болезнь, соотнесенных с вариантами в разных локусах и природе болезни у бессимптомных пациентов группы риска.
Описание генов и мутаций
улучшает понимание патогенеза заболеваний и способствует развитию таких направлений, как:
- чувствительная специфическая диагностика прямым обнаружением мутации;
- популяционный скрининг на носительство для выявления групп риска по болезни у обследуемых или их потомства;
- клеточные и животные модели;
- лекарственная терапия для профилактики и лечения болезни или замедления ее протекания;
- лечение заменой гена.
Slide 1
Выполнила: Голубева Ю.В. 410гр
Slide 2
Одна из основных задач современной генетики
заключается в выяснении природы комплексных
признаков, к которым в частности относятся
многие распространенные болезни человека и
характеристики продуктивности
сельскохозяйственных животных. Стартовым
этапом на пути решения этого вопроса
является
Slide 3
Картирование генов -
Slide 4
Стратегические подходы
к картированию геномов
Slide 5
Стратегия прямой
генетики
Различия во времени появления,
необходимой методической базой и
спектре возможностей. Функция гена
известна хотя бы частично.
Slide 6
Функциональное
картирование
Основа - наличие некоторой информации о
биохимическом полиморфизме, лежащем в
основе того или иного наследственного
признака.
начинается с выделения в чистом виде
белкового продукта гена.
к нему по аминокислотной последовательности
подбирают вырожденные праймеры
проводят ПЦР-скрининг
Slide 7
Большинство генов, функция которых
была известна, уже клонированы и
локализованы.
Slide 8
Для большинства генов, которые
были локализованы, характерны
структурные аномалии (как
правило, это гены, ответственные за
наследственные заболевания
человека), что существенно
облегчает заключительную стадию
поиска гена - выделение и
локализацию гена.
Slide 9
Кандидатное
картирование
информация о функциональном
изменении недостаточно полна, чтобы
точно указать ген
Информации достаточна для того,
чтобы выдвинуть предположения о
возможных кандидатах либо по их
функции, либо по положению на
хромосоме
Slide 10
Общее:
при функциональном, и при
кандидатном подходе клонирование
гена, как правило, предшествует его
точной локализации в геноме
локализовать ген означает пройти путь
от его функции к локализации на
хромосоме (позиции)
Slide 11
Стратегия обратной
генетики
От хромосомной карты к функции
гена. Возникло благодаря появление в
конце 80-х годов множества
высокополиморфных ДНК-маркеров
Slide 12
Позиционное
картирование
локализация гена при отсутствии всякой
функциональной информации о нем
место гена на карте устанавливают по
результатам анализа его сцепления с
ранее локализованными генетическими
маркерами, далее исследуется уже
область генома рядом с маркером
Slide 13
Генетический маркёр
(genetic marker)
Ген, детерминирующий
отчетливо выраженный
фенотипический признак,
используемый для
генетического картирования
и индивидуальной
идентификации организмов
или клеток. Также в качестве
генетических маркеров
могут служить целые
(маркерные) хромосомы.
Slide 14
Минусы
ограничением позиционного
подхода является низкая
разрешающая способность
генетических карт - интервал между
двумя соседними маркерами, в
котором локализован ген, может
оказаться слишком велик и
недоступен физическому
картированию.
Slide 15
Картирование генов –
виды
Физическое картирование
Генетическое картирование
Цитогенетическое(цитологическое)
картирование
Slide 16
Физическое
картирование
обширная группа методов, позволяющая строить
карты генома (обычно их называют физическими)
высокого уровня разрешения и определять
расстояния между локализуемыми нуклеотидными
последовательностями с точностью от нескольких
десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.
Пример: картирование
генов с помощью
хромосомных мутаций
Slide 17
Типы физического
картирования
рестрикционное картирование
RH-картирование
клонирование в YAC (от англ. yeast artificial
chromosome)
BAC (от англ. bacterial artificial
chromosome) в космидах, плазмидах и
других векторах и контиг-картирование на
их основе
секвенирование ДНК
Slide 18
В том случае, когда известна
последовательность ДНК интересующего
локуса, эту последовательность можно
использовать для гибридизации с
хромосомами in situ, и место гибридизации
будет однозначно указывать на локализацию
локуса в определенном районе определенной
же хромосомы
Slide 19
Генетическое
картирование
картирование, основанное
на методах классической
генетики - определении
групп сцепления, частоты
рекомбинации и
построении генетических
карт, где единицей
измерения служат
проценты рекомбинации
Slide 20
Первый ген человека
был локализован на
Х-хромосоме в 1911
г.
Первый аутосомный
ген - только в 1968 г
Slide 21
Генетическая карта
(genetic map
Схема взаимного
расположения генов на
хромосоме (в группе
сцепления) и их
распределения по
разным хромосомам,
как правило,
включающая данные об
относительном
удалении генов друг от
друга (генетические
расстояния).
Slide 22
Генетическая карта
американской норки
включает 127 генов
(черный текст) и 39
микросателлитных
последовательностей
(красным текст).
Разным цветом
выделены районы
хромосом норки
гомологичные
хромосомным.
Slide 23
Преимущества
большое число консервативных групп
сцепления
создание банков клеточных культур
для локализации вновь возникшей
мутации к настоящему моменту есть
набор маркерных генов для каждой
хромосомы.
Slide 24
Построение
генетической карты
Шаг 1: формирование групп
сцепления генов и исследование их
взаимного расположения(Скрещивания
проводятся до тех пор, пока не удастся выявить
сцепленное наследование анализируемой
мутации с маркерными мутациями какой-либо
хромосомы)
Шаг 2: подсчитывание расстояния
между исследуемым геном и уже
известными маркерными генами
Slide 25
Единицы измерения
Генетическое расстояние между линейно
расположенными генами, выраженно в процентах
рекомбинации -
Два гена на хромосоме
находятся на расстоянии 1
сМ, если вероятность
рекомбинации между ними
в процессе мейоза
составляет 1%.
Классический пример Моргана –
расстояния между генами
дрозофилы
Slide 26
4 степени надежности
локализации данного гена
подтвержденная (установлена в двух и
более независимых лабораториях или на
материале двух и более независимых тестобъектов),
предварительная (1 лаборатория или 1
анализируемая семья),
противоречивая (несовпадение данных
разных исследователей),
сомнительная (не уточненные
окончательно данные одной лаборатории)
Slide 27
Минусы:
частота рекомбинации в
разных точках генома
различна, и расстояние
может существенно
варьировать
Необходим
тщательный
анализ
родословной
(если
картируется ген
заболевания)
в результате карты
сцеплений не отражают
реальных физических
расстояний между
маркерами и генами
на хромосомах.
Slide 28
Цитогенетическое
картирование
осуществляется с применением
методов цитогенетики, когда для
локализации каких-либо
нуклеотидных
последовательностей и
определения их взаимного
расположения используются
цитологические препараты
Slide 29
Цитологические карты
Метод цитологических карт основан на
использовании хромосомных перестроек –
перекрывающихся делеций.
При облучении и действии других
мутагенов в хромосомах часто
наблюдаются потери (делеции)
или вставки (дупликации)
небольших фрагментов,
сравнимых по величине с одним
или несколькими локусами.
Slide 30
Принципы:
Используются гетерозиготы по хромосомам, одна из которых
будет нести группу следующих друг за другом доминантных
аллелей, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же
генов.
Если в хромосоме с доминантными генами произошла утрата
отдельных генов, например DE, то у гетерозиготы ABC/abcde будут
проявляться рецессивные признаки de. На этом принципе основан
метод перекрывающихся делеции, используемый при построении
цитологических карт.
Slide 31
Методы
дифференциального
окрашивания позволяют
идентифицировать на
препарате как отдельную
хромосому, так и любой
участок хромосомы
Разработанный на дрозофиле
специальный метод
перекрывающихся делеций был
использован для
цитологического картирования
генов у представителей многих
видов.
Slide 32
Хромосомные комплексы китайского хомячка
(А), мыши (Б) и их соматического гибрида (В)
Slide 33
Сравнение генетических и
цитологических карт хромосом
показывает их соответствие:
чем больший процент
кроссинговера разделяет пару
генов, тем больше и физическое
расстояние между ними.
Slide 34
Запись локализации
гена
Согласно официально утвержденной номенклатуре
(ISCN,1978), каждая хромосома человека после
дифференциальной окраски может быть разделена на
, нумерация которых начинается от
центромеры вверх (
), либо вниз
).
в каждом
участке тоже нумеруются в аналогичном порядке. Крупные
полосы разделяются на более мелкие
Slide 35
Slide 36
Алгоритм решения
задач на картирование
генов
Slide 37
Пример:
Составьте карту хромосомы,
содержащую гены, если
частота кроссинговера между
генами и равна 2,5%, и -
3,7%, и -6%, и - 2,8%, и -
6,2%, и - 15%, и - 8,8%
Slide 38
Slide 39
Используемая
литература
Э. Р. Рахманалиев, Е. А. Климов, Г. Е. Сулимова МЕТОДЫ
КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
КАРТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАДИАЦИОННЫХ
ГИБРИДОВ (RH КАРТИРОВАНИЕ)
Аксенович Т.И. Проблемы картирования QTL (Институт
цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск)
Мяндлина Г.И. Молекулярные основы медицинской
генетики(кафедра биологии и общей генетики,
медицинского факультета РУДН)
В.И. Иванов Генетика Учебник для вузов, 2006
Генетические и физические карты По общепринятой классификации методы картирования геномов подразделяют на две категории: p Генетическое картирование p Физическое картирование 2
Составление генетических карт p p Маркёры – позиции каких-либо отличительных признаков. В качестве маркёров на протяжении десятилетий использовались гены, определяющие легко различимые фенотипы. Для более сложных карт использовались в качестве фенотипических признаков организма его биохимические особенности. Карта, основанная на генах, не может быть очень подробной. Также только часть всего числа генов существует в удобно различимых аллельных формах. 3
ДНК-маркёры ДНК–маркёры – нанесённые на карту особенности, которые не являются генами. Всякий пригодный ДНК–маркёр должен иметь два аллеля, как и ген–маркёр. Этому требованию удовлетворяют три типа особенностей последовательности ДНК: -Полиморфизмы длины фрагментов рестрикции (RFLP); -Полиморфизмы длины простых последовательностей (SSLP); -Полиморфизмы отдельных нуклеотидов (SNP). 4
1 ДНК-маркёр. Полиморфизмы длины рестриктов RFLP – первый тип ДНК-маркёров, который был полностью изучен. Ферменты рестрикции разрезают ДНК в определённых сайтах узнавания. Эта специфичность означает, что обработка молекулы ДНК ферментом рестрикции должна производить один и тот же набор фрагментов. С молекулами геномной ДНК так происходит не всегда, так как некоторые участки рестрикции полиморфны и существуют в виде двух аллелей: один показывает правильную последовательность для участка рестрикции и потому разрезается ферментом при обработке ДНК, а второй аллель несёт видоизменение последовательности, так что участок рестрикции уже не опознаётся. В результате этого два смежных фрагмента 5 рестрикции остаются связанными вместе, что
Визуализация RFLP 2. ПЦР используется гораздо чаще. Затравки для ПЦР разрабатываются таким образом, чтобы они отжигались к обеим сторонам полиморфного участка, и RFLP типизируется путём обработки размноженного фрагмента ферментом рестрикции и последующего пробега образца в агарозном геле. 8
2 ДНК-маркёр. Полиморфизмы длины простых последовательностей SSLP – множества повторных последовательностей, которые показывают изменения длины; различные аллели содержат разное число повторных единиц. Существуют SSLP двух типов: минисателлиты и микросателлиты. Два варианта некоторого STR (микросателлита) с повторяющейся последовательностью GA 9
Типы SSLP Минисателлиты (переменное число тандемных повторений, или VNTR). Повторная единица может иметь длину до 25 п. н. 2. Микросателлиты (простые тандемные повторения, или STR). Повторяющийся элемент – 13 п. н. или меньше. 1. 10
Типы SSLP ДНК-маркёры, основанные на микросателлитах, более популярны, чем основанные на минисателлитах, по двум причинам: -Минисателлиты неравномерно распределены по всему геному, чаще встречаются в теломерных областях на концах хромосом, микросателлиты более равномерно распределены в геноме. -точная типизация полиморфизма длины путём ПЦР возможна при длине последовательностей не более 300 п. н. , а большинство минисателлитных аллелей 11
3 ДНК- маркёр. Полиморфизмы отдельных нуклеотидов SNP – это позиции генома, в которых некоторые индивидуумы имеют один нуклеотид, например, G, а другие имеют отличающийся от него нуклеотид – С. 12
Большинство SNP имеют 2 аллеля, поскольку SNP возникают, когда в геноме происходят точечные мутации, преобразовывающие один нуклеотид в другой. Если подобная мутация случится в репродуктивных клетках, то один или более его потомков могут унаследовать эту мутацию, и в итоге SNP станет закреплённым в популяции. 13
Методы типизации SNP Методы базируются на анализе гибридизацией олигонуклеотидов. -Технология чипов ДНК - Методы гибридизации в растворе - Анализ лигированием олигонуклеотидов (OLA) - Система размножения термостабильных мутаций, или тест ARMS. 14
Методы типизации SNP Технология чипов ДНК На поверхность стеклянной пластины площадью 2 см 2 с множеством различных олигонуклеотидов пипеткой наносится предназначенная для тестирования ДНК, помеченная флюоресцентным маркёром. Гибридизация детектируется путём анализа чипа с помощью флюоресцентного микроскопа. Позиции, в которых испускается флюоресцентный сигнал, показывают, какие олигонуклеотиды 1. 15
Методы типизации SNP 2. Метод гибридизации в растворе Используется пара меток, в которые входит флюоресцентный краситель и вещество, гасящее флюоресцентный сигнал при сближении с испускающим его красителем. Краситель прикрепляется к одному концу олигонуклеотида, гасящее вещество – к другому концу. Если между олигонуклеотидом и тестируемой ДНК происходит гибридизация, то данное спаривание оснований нарушается, гаситель отрывается от красителя, и тот вырабатывает флюоресцентный сигнал. 16
Методы типизации SNP 3. Анализ лигированием нуклеотидов (OLA) Применяются два олигонуклеотида, которые отжигаются смежно другу, при этом 3’-конец одного из них точно попадает в SNP. Этот олигонуклеотид образует полностью спаренную основаниями структуру, если в матричной ДНК присутствует одна версия SNP, и когда это происходит, данный олигонуклеотид может быть 17
Методы типизации SNP 4. Система размножения термостабильных мутаций (тест ARMS) Контрольным олигонуклеотидом выступает одна из пары затравок ПЦР. Если контрольная затравка отжигается к SNP, то он может быть продолжен с помощью полимеразы Taq и ПЦР может иметь место, но если она не отжигается из-за того, что присутствует альтернативная версия SNP, то никаких продуктов ПЦР не 18
Сцепление генетических признаков Генетическое картирование основано на законах наследственности, описанных Грегором Менделем ещё в 1865 году. Помимо первых двух законов Менделя, встречаются ещё два случая необычного сцепления: -Неполное доминирование (гетерозиготная форма проявляет фенотип, промежуточный между двумя гомозиготными формами); -Кодоминирование (гетерозиготная форма показывает оба гомозиготных фенотипа) 19
Определяющий шаг в развитии генетического картирования Когда в 1900 году законы Менделя были переоткрыты, выяснилось, что полное сцепление, которое ожидалось между многими парами генов, не осуществилось. Пары генов или наследовались независимо, или показывали лишь неполное сцепление: иногда наследовались вместе, иногда порознь. p Разрешение этого противоречия и стало решающим шагом в развитии составления генетических карт. p 20
Рассуждения Томаса Моргана Неполное сцепление объясняется поведением хромосом во время мейоза. p Процесс кроссинговера (или рекомбинации) был открыт бельгийским цитологом Янсеном в 1909 году и помог Моргану объяснить неполное сцепление. Рассмотрим эффект, который имеет кроссинговер на наследование генов. p 21
Эффект кроссинговера Имеется два возможных сценария: p Между генами А и В не происходит кроссинговер. Тогда две гаметы имеют генотип АВ, две другие – аb. p Между генами А и В происходит кроссинговер. Это приводит к обмену сегментами ДНК между гомологичными хромосомами. В итоге каждая гамета имеет отличный от других генотип: AB, a. B, Ab и ab. Помимо гамет с родительскими генотипами появляются гаметы с 22
Составление генетических карт Когда Морган объяснил неполное сцепление кроссинговером, он изобрёл способ наносить на карту отдельные позиции генов в хромосоме. Допустим, кроссинговер является случайным событием, а значит, может произойти в любой позиции на протяжении пары вытянутых одна вдоль другой хроматид. Если это верно, то два гена, расположенные близко друг к другу, будут разделяться кроссинговерами реже, чем гены, лежащие дальше друг от друга. Частота, с которой гены разъединяются кроссинговерами, будет прямо пропорциональна отдалению их друг от друга. Поэтому частота рекомбинации является мерой расстояния 23
Анализ сцепления генетических признаков у организмов различного типа. Включает три ситуации: p Анализ сцепления генетических признаков у видов наподобие плодовой мушки и мыши, с которыми можно выполнять эксперименты по скрещиванию; p Анализ сцепления генетических признаков у людей, с которыми нельзя проводить эксперименты, но можно изучать родословные; p Анализ сцепления генетических признаков у бактерий, которые не 24
Анализ сцепления генетических признаков при возможности проведения скрещивания Метод основан на анализе потомства от экспериментальных скрещиваний, при известных генотипах родителей. Обычно используется анализирующее скрещивание. Этот метод применим ко всем эукариотам, но неприменим к человеку из этических соображений. 25
Составление генетической карты на основе анализа родословной человека Зачастую из-за соблюдения научной и медицинской этики учёные могут оперировать лишь скудными данными, так как браки редко дают удобное анализирующее скрещивание, и генотипы многих членов семей могут быть неизвестны ввиду смерти или нежелания сотрудничать. Обыкновенно, чтобы решить необходимую генетическую задачу, достаточно знать дополнительно генотип хотя бы одного родственника, но по разным причинам это невозможно. 26
Составление генетических карт бактерий Главная трудность состоит в том, что бактерии гаплоидны и не подвергаются мейозу. Поэтому используются три способа, способные вызвать кроссинговер: p В процессе коньюгации происходит передача эписомы (сегмент хромосомной ДНК длиной до 1 млн. п. н.) p Трансдукция (передача фрагмента ДНК длиной до 50 тыс. п. н. через бактериофаг) p Трансформация (клетка-реципиент 27
Составление физических карт Полученная исключительно генетическими методами карта не будет полностью точна. Это обусловлено следующими причинами: 1. Разрешение генетической карты зависит от числа кроссинговеров, которые были набраны. Для микроорганизмов это не главная проблема, поскольку они могут быть получены в любом количестве. Проблема с людьми и другими эукариотами в том, что невозможно получить большое число потомков, так как может быть изучено сравнительно 28
Составление физических карт 2. Генетические карты имеют ограниченную точность. На картинке изображено сравнение физической и генетической карт дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Сравнение показывает, что порядок двух верхних маркёров на генетической карте неверен и также есть различия в относительном 29
Составление рестрикционных карт Простейший способ составления рестрикционной карты – сравнение размеров фрагментов, полученных при переваривании молекулы ДНК двумя разными ферментами рестрикции. Выбрать единственно верную карту позволяет дополнительная обработка исходной ДНК одним ферментом с предотвращением протекания переваривания до конца. Это называется частичной рестрикцией. Масштаб рестрикционной карты ограничивается длиной рестриктов. Рестрикционное картирование более приемлемо для маленьких молекул. 31
Составление рестрикционных карт Возможно ли использование рестрикционного анализа для картирования геномов размером более 50 тыс. п. н. ? Да, ограничения рестрикционного картирования могут быть ослаблены за счёт подбора ферментов, которые имеют редкие участки разрезания в целевой молекуле ДНК («редкощепящие рестриктазы») 32
Метод OFAGE Электрофорез в геле с ортогонально чередующимся полем. Таким образом, каждое изменение поля вынуждает молекулы перестраиваться, короткие молекулы перестраиваются и Электрическое поле чередуется мигрируют через гель между двумя парами быстрее длинных. За счёт электродов, каждая из которых такого приёма позволяются помещена по углом 45° к более длинные фрагменты, продольной линии геля. чем при обычном электрофорезе. К подобного рода методам относят также CHEF – электрофорез в геле с однородными электрическими полями и 33 FIGE – электрофорез в геле с обращением поля.
Непосредственное наблюдение участков рестрикции в молекулах ДНК. Для нанесения на карту участков рестрикции можно использовать методы, не связанные с электрофорезом. p Метод оптического картирования: позиции участков рестрикции определяются путём непосредственного наблюдения разрезанных молекул ДНК в микроскоп. Для закрепления ДНК на предметном стекле используют вытягивание гелем и расчёсывание молекул. p Для вытягивания гелем хромосомную ДНК переводят во взвесь в расплавленной агарозе и помещают на предметное стекло микроскопа. По мере охлаждения и затвердевания геля молекулы ДНК вытягиваются. p Для расчёсывания волокна ДНК приготовляют путём погружения покрытого силиконом покровного стекла в раствор ДНК, выдерживая его там в течение 5 минут. Далее вынимают стекло из раствора. Сила, необходимая для 34 протягивания ДНК через поверхностный мениск, заставляет каждую из них вытягиваться в линию. При засыхании ДНК
Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) В этой методике маркёром является последовательность ДНК, которая отображается путём гибридизации с флюоресцентным зондом. Ненарушенная хромосома исследуется путём её зондирования меченой молекулой ДНК. Для работы метода ДНК в хромосоме денатурируется(высушивается на предметном стекле и обрабатывается 36
FISH в действии 1. 2. Первоначально метод использовался с метафазными хромосомами, но их сильная уплотнённость не позволяла составлять карты с высокой разрешающей способностью. В 1995 году был разработан ряд методов FISH более высокого разрешения. Оно достигалось за счёт изменения характера изучаемого хромосомного аппарата. Если метафазные хромосомы слишком сжаты для крупномасштабного картирования, то нам следует использовать хромосомы в более вытянутом виде. Добиться этого можно двумя способами. Механически вытянутые хромосомы могут быть получены за счёт изменения метода приготовления препарата, применяемого для выделения хромосом из метафазных ядер. Неметафазные хромосомы используются, потому что во всех стадиях клеточного цикла, кроме метафазы, хромосомы пребывают в естественном для них 37 развёрнутом состоянии. Интерфазные хромосомы
Картирование с помощью меченых участков последовательности (STS) В настоящее время это самый мощный метод физического картирования. Меченый участок последовательности, или STS – короткая последовательность ДНК, 100 -500 п. н. в длину, которая легко опознаётся и лишь единожды встречается в хромосоме или изучаемом геноме. Чтобы нанести на карту набор STS, необходимо располагать множеством перекрывающихся фрагментов ДНК из отдельной хромосомы или полного генома. Какие фрагменты содержат какие STS, определяется методом гибридизационного анализа, или, чаще, ПЦР. Любая уникальная последовательность ДНК может быть использована в качестве STS. Для этого последовательность ДНК должна быть известна, а STS должен иметь уникальное 38 местоположение на изучаемой хромосоме.
Методы получения STS 1. 2. 3. Ярлыки экспрессируемых последовательностей – короткие последовательности, получаемые анализом клонов к. ДНК. Полиморфизмы длины простой последовательности (SSLP) Случайные геномные последовательности – получают секвенированием случайных частей клонированной геномной к. ДНК. 39
Фрагменты ДНК для картирования с помощью STS Иначе реактив для картирования; существуют в виде библиотеки клонов и радиационных гибридов. Радиационный гибрид – клетка грызуна, содержащая фрагменты хромосом другого организма. При разбиении хромосомы на фрагменты большая доза излучения давала большее число фрагментов. Слияние стимулируется химически (полиэтиленгликолем) или биологически – вирусом Сёндай. 40
Выводы p p p Карты геномов – опорная схема для проектов секвенирования, так как они позволяют проверять точность собранной последовательности ДНК. Генетические карты строят по результатам экспериментов по скрещиванию и анализа родословных, физические карты – посредством прямого наблюдения молекул ДНК. В самых первых генетических картах маркёрами выступали гены, аллели которых можно было легко отличать (по резко отличным фенотипам), ныне же ДНК-маркёрами являются полиморфизмы длины фрагмента рестрикции (RFLP), полиморфизмы длины простой последовательности (SSLP) и полиморфизмы отдельных нуклеотидов (SNP). Все они легко типизируются посредством ПЦР. Анализ сцепления генетических признаков позволяет определить частоту рекомбинации между парой маркёров. Для многих организмов анализ сцепления генетических признаков прослеживается при помощи запланированных 41 экспериментов по скрещиванию. С людьми их проведение
Выводы p p p Генетическое картирование генома человека опирается на сведения, почёрпнутые из анализа родословной. Низкое разрешение генетических карт уточняется физическим картированием. В молекуле ДНК позиции участков рестрикции определяются рестрикционным картированием. Флюоресцентная гибридизация более продуктивная, в ней препарат зондируется маркёром, меченным флюоресцентной меткой. Позиция гибридизации определяется микроскопированием. Наиболее подробные физические карты получаются методом картирования содержания меченых участков последовательности (STS). Позиция маркёра на карте определяется фрагментами из коллекции, содержащими копии маркёра. 42
Карта - это графическая схема, позволяющая вычислить, где вы располагаетесь и как добраться туда, куда вы хотите попасть. Карта генома, соответственно, - это графическая схема, которая помогает исследователям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важны и интересны.
Карта генома может содержать различную информацию: расположение специфических генов или регуляторных сайтов, но она также содержит большие пробелы, потому что постоянно пересматривается в соответствии с новыми данными о геноме, которые получают ученые.
В простейшем виде карта генома представляет собой прямую линию, как и молекулы ДНК, которые составляют геном. По всей длине расположены различные ориентиры, помеченные буквами и цифрами, которые позволяют исследователям идентифицировать отдельные признаки.
Карта - не одно и то же, что и последовательность оснований генома. Расположение некоторых генов на карте можно вычислить без определения последовательности оснований. Фактически, карта помогает секвенировать геном, давая ключи к взаимному расположению специфических фрагментов ДНК в мозаике генома.
Кроме того, карта обеспечивает ценную информацию, которую не может предоставить секвенирование генома. Секвенс генома - это всего лишь последовательность из одних и тех же четырех букв в бесконечной отупляющей вариации. Даже ученый не сможет, взглянув на последовательность оснований ДНК, мгновенно вычислить ее функцию. Вставив последовательность оснований на правильное место карты, вы получаете ключ к разгадке функции этой последовательности, если только она существует (рис. 6.2).
Вот один из способов использования учеными генетической карты. Предположите, что они хотят выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание. Сначала обследуют несколько семей, страдающих этим заболеванием, чтобы узнать, с какими генетическими признаками связана болезнь. Гены любых признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой вероятностью могут быть локализованы на одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Они могут служить маркерами для искомого гена болезни.
Определив несколько маркеров с известным расположением па хромосоме, ученые могут с большой точностью, до нескольких миллионов пар оснований, установить расположение гена, вызывающего болезнь. Затем они могут сфокусировать усилия на части генома, несущей указанный ген, и искать ген, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных люден, или ген, функции которого могут быть связаны с болезнью.
Именно так были идентифицированы гены, связанные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако этот путь долог и трудоемок, поэтому целью генетиков остается разработка более детальных карт геномов. Использование таких карт позволит исследователям с точностью находить в геноме последовательности, которые им нужны.
Существует два типа генетических карт: карты генетического сцепления и физические карты.
Карты генетического сцепления показывают порядок расположения генов на хромосоме и относительные расстояния между ними. Это карты, аналогичные карте А.Х. Стюртеванта, которая описана в главе 4.
Карта Стюртеванта была построена на генетических признаках, физически видимых у плодовых мушек, с которыми он работал. Сегодня гораздо более сложные карты сцепления генов строятся на определении наследования специфических последовательностей ДНК.
Физические карты показывают количество оснований ДНК между двумя генетическими метками. Они основаны на сайтах (точках), помеченных определенными последовательностями оснований (СТС). СТС - это последовательность в ДНК, которая находится в единственной точке генома. Ее протяженность составляет несколько сот оснований. Она может быть частью гена, но это не обязательно.
Поскольку СТС встречается только в одном месте генома, то как только она попадается во фрагменте ДНК при секвенировании, вы можете определить расположение фрагмента в геноме.
Новые геномные карты совмещают черты обоих типов карт. Карты, которые включают последовательности и расположение всех генов организма, построены для более 150 организмов. Однако большинство из них - вирусы с очень маленькими геномами, что указывает на сложности, с которыми сталкиваются «картографы» геномных карт.
Картирование генов gene mapping, mapping - картирование генов.
Oпределение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов; используют три основные группы методов К.г. - физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза межгенных расстояний - в нуклеотидах), генетическое (определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др.) и цитогенетическое (гибридизации in situ <in situ hybridization >, получение монохромосомных клеточных гибридов <monochromosomal cell hybrid >, делеционный метод <deletion mapping > и др.); в генетике человека приняты 4 степени надежности локализации данного гена - подтвержденная (установлена в двух и более независимых лабораториях или на материале двух и более независимых тест-объектов), предварительная (1 лаборатория или 1 анализируемая семья), противоречивая (несовпадение данных разных исследователей), сомнительная (не уточненные окончательно данные одной лаборатории); в Приложении 5 приведена сводка (по состоянию на 1992-93) структурных генов, онкогенов и псевдогенов в геномах человека и - включая некоторые мутации - мыши.
(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)
Смотреть что такое "картирование генов" в других словарях:
картирование генов - Определение положения данного гена на какой либо хромосоме относительно других генов; используют три основные группы методов К.г. физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза… …
Картирование генов - определение положения данного гена на какой либо хромосоме относительно других генов. Генетическое картирование предполагает определение расстояний по частоте рекомбинаций между генами. Физическое картирование использует некоторые методы… … Словарь по психогенетике
картирование [генов] с помощью бэккроссирования - Генетический метод картирования, основанный на получении бэккроссных гибридов родственных форм и анализе расщепления вариантов аллелей, полиморфных по длинам рестрикционных фрагментов; наиболее распространен данный метод в картировании генов у… … Справочник технического переводчика
Backcross mapping картирование [генов] с помощью бэккроссирования. Генетический метод картирования, основанный на получении бэккроссных гибридов родственных форм и анализе расщепления вариантов аллелей, полиморфных по длинам рестрикционных… …
Картирование сравнительное генов млекопитающих - * картаванне параўнальнае генаў млекакормячых * comparative mapping of mammalian genes информативное сопоставление генетических карт человека и любого из др. видов млекопитающих). Они должны быть одновременно хорошо изучены и далеко отстоять друг …
Картирование - * картаванне * mapping установление позиций генов или каких то определенных сайтов (см.) вдоль нити ДНК (. Карта) … Генетика. Энциклопедический словарь
Картирование с помощью облученных гибридов [клеток] - * картаванне з дапамогай апрамененых гібрыдаў [клетак] * radiated hybrid mapping модификация метода картирования генов с использованием гибридизации соматических клеток. Клетки гибридного клона «грызун Ч человек», содержащие только хромосому 1… … Генетика. Энциклопедический словарь
Radiation hybrid mapping картирование с помощью облученных гибридов [клеток]. Модификация метода картирования генов с использованием гибридизации соматических клеток клетки гибридного клона “грызун ˟ человек”, содержащие только 1 хромосому… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.
Установление порядка расположения генов и относительного расстояния между ними в группе сцепления … Большой медицинский словарь